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生化試劑應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題的探討
點(diǎn)擊次數(shù):3770 更新時(shí)間:2016-03-21

 1 試劑空白

試劑空白吸光度是反映試劑質(zhì)量的指標(biāo)之一。每種試劑都有一定的空白吸光度范圍,試劑空白吸光度的改變往往提示該試劑的變質(zhì);如利用Trinder反應(yīng)為原理的檢測(cè)試劑會(huì)因含酚類(lèi)物質(zhì)被氧化為醌而變?yōu)榧t色。堿性磷酸酶、r一谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、淀粉酶等檢測(cè)試劑會(huì)因基質(zhì)分解出硝基酚或酚基苯胺而變黃。有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負(fù)反應(yīng),在放置過(guò)程中其試劑空白吸光度會(huì)因NADH自行氧化為NAD+而下降。原則上,吸光度上升的反應(yīng),其試劑空白吸光度越低越好,不能超過(guò)一個(gè)高限;相反,吸光度下降的反應(yīng),其試劑空白吸光度不能低于一個(gè)低限。因此,試劑空白吸光度限值,常作為程序參數(shù)輸入儀器,如經(jīng)核查超限,儀器會(huì)自動(dòng)報(bào)警,提示更換試劑。需要指出的是,還原型輔酶I(或II)等投料量不足或劣質(zhì)的原料,往往需要加大用量,才使“表觀”吸光度上升,湊合過(guò)試劑空白核對(duì)的“關(guān)”,其后果為如下情況:

1.1 線性范圍變窄 現(xiàn)象:高值測(cè)不高。原因:生產(chǎn)試劑時(shí)有效成分投料量不足;試劑成份穩(wěn)定性較差。

1.2 靈敏度變低現(xiàn)象:酶促反應(yīng)速度曲線斜率下降,測(cè)定結(jié)果有嚴(yán)重系統(tǒng)誤差。原因:試劑底物濃度不足。

1.3 低值偏高 現(xiàn)象:試劑空白的變化曲線(吸光度VS時(shí)間)明顯波動(dòng)。原因:試劑自身不穩(wěn)定,自行分解;工具酶純度不夠,雜酶含量超限,導(dǎo)致干擾作用。

2 樣品信息

樣品的溶血、脂血、黃疸等會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾。因此,應(yīng)根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性,采用雙波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)的檢測(cè)模式,并在結(jié)果計(jì)算中扣除因溶血、脂血、黃疸引起的影響,減少干擾程度。

3 測(cè)定范圍

每種待測(cè)物都有一個(gè)可測(cè)定的濃度或活性范圍,樣品結(jié)果若超過(guò)此范圍,分析儀將顯示結(jié)果超過(guò)范圍的提示。表示試劑已經(jīng)變質(zhì),應(yīng)更換合格試劑。

4 底物耗盡

使用連續(xù)監(jiān)測(cè)法、兩點(diǎn)法測(cè)定酶活性時(shí),若酶活性非常高,底物接近被耗盡,吸光度上升或下降會(huì)超過(guò)某一吸光度變化范圍,監(jiān)測(cè)期的吸光度將偏離線性,使測(cè)定結(jié)果不可靠。

5 酶的預(yù)活化

測(cè)定血清中的某些酶,如CK,離體(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巰基(一SH)被氧化造成的。只有通過(guò)適當(dāng)?shù)倪€原作用才能重新激活。如CK—NAC試劑盒即含有CK活化劑,名為N一乙酰半胱氨酸。實(shí)驗(yàn)研究證明,NAC對(duì)血清中已失活的CK活化過(guò)程約需180 S。這就是CK測(cè)定為什么要延遲時(shí)間較長(zhǎng)的理論依據(jù)。在AST,ALT采用IFCC推薦方法測(cè)定時(shí)需要磷酸吡哆醛預(yù)活化。需要強(qiáng)調(diào):含有活化劑的生化試劑,其測(cè)定酶活性的結(jié)果要高些。

6 校準(zhǔn)與結(jié)果溯源性

酶的校正:要滿足在同一方法學(xué)、同一測(cè)定條件、與理論計(jì)算的FACTOR值差異不大,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明顯影響因素,方可進(jìn)行校正。

檢驗(yàn)結(jié)果溯源性,得建立一個(gè)可靠的參考系統(tǒng)作為準(zhǔn)確性基礎(chǔ),然后將準(zhǔn)確性轉(zhuǎn)移到常規(guī)方法測(cè)定中去,使常規(guī)方法測(cè)定結(jié)果可溯源到參考系統(tǒng)所提供的準(zhǔn)確性基礎(chǔ)上來(lái)。在實(shí)現(xiàn)溯源性目標(biāo)過(guò)程中,永遠(yuǎn)以患者新鮮標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,以方法學(xué)對(duì)比試驗(yàn)方法為驗(yàn)證手段。方法學(xué)對(duì)比試驗(yàn)常采用回歸方程進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,假如斜率接近1,截距較小,這意味著實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法對(duì)標(biāo)本測(cè)定結(jié)果和溯源目標(biāo)參考系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果非常接近。

臨床化學(xué)中參考標(biāo)準(zhǔn)(二級(jí)標(biāo)準(zhǔn))要有通用性,但生產(chǎn)廠家提供的校準(zhǔn)液并非通用的,只適用于某一特定的分析系統(tǒng)。

校準(zhǔn)液標(biāo)示值往往是按其基質(zhì)偏差修正的,所以標(biāo)示值并非實(shí)際值。校準(zhǔn)液、質(zhì)控血清通常是經(jīng)過(guò)處理的混合人或動(dòng)物血清,這種制備物在特定分析系統(tǒng)中往往與人新鮮血清反應(yīng)性不同而產(chǎn)生基質(zhì)偏差。如總膽固醇測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)研究指出:校準(zhǔn)液酶法測(cè)定回收結(jié)果偏低可達(dá)5%~7%。

7 試劑抗干擾作用的合理性有些液體雙試劑,其實(shí)質(zhì)并不真正具備抗干擾的能力而只是解決了試劑的液體化和穩(wěn)定性問(wèn)題。如,ALT試劑盒中,NADH在pH7.5~7.8水溶液中極不穩(wěn)定,在pH>8.7時(shí)才能穩(wěn)定保存。因此,為了保證試劑穩(wěn)定性,液體雙試劑的R1需要維持pH>8.7,但此時(shí)LDH活性大大下降,就失去消除內(nèi)源性丙酮酸的功能,只有加入試劑R2后,反應(yīng)混合液的pH下降至LDHzui適pH,在經(jīng)過(guò)延遲時(shí)間60 S后,才能消除內(nèi)源性丙酮酸的干擾。再如,Tfinder反應(yīng)中抗Vc干擾問(wèn)題:由于維生素c易氧化,樣品中Vc會(huì)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫,而產(chǎn)生負(fù)干擾。因此,在試劑R1中加入抗壞血酸氧化酶,這種方法是有效的,但不一定有很大的意義。因?yàn)閂c干擾必須同時(shí)具備二個(gè)條件:a)Vc攝入量較多;b)采血后立即測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明離體血清中Vc在90 min后會(huì)全部被氧化。又如,使用胺類(lèi)新色原。a)分子共軛結(jié)構(gòu)特性使得靈敏度提高,相應(yīng)可以減少樣本用量,zui終能有效地降低干擾物的量.b)使生成胺類(lèi)色素原zui大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上,以避開(kāi)黃疸、溶血干擾。如:亞鐵一H 0 ,能有效避免黃疸干擾的理論依據(jù)是亞鐵與H。0。親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膽紅素。甘油三酯測(cè)定,有人主張選用雙試劑方法消除內(nèi)源性甘油,這個(gè)方法是可行的,但忽視了一個(gè)化學(xué)平衡理論。因?yàn)樗械孽ピ谒芤褐卸疾皇呛?jiǎn)單地以酯的形式存在,而是以水解與酯化相平衡的形式存在。在一個(gè)平衡體系中,如果去除游離甘油,這個(gè)平衡就向生成甘油方向移動(dòng),甘油三酯就會(huì)重新水解,生成新的甘油,達(dá)到新的平衡,因此樣品與R1試劑孵育時(shí)間越長(zhǎng),測(cè)得甘油三酯值就越低。甘油三酯測(cè)定,不僅要去除游離甘油,而且還要克服樣本含量真實(shí)性發(fā)生的變化,試劑中必須加入甘油激酶,并且延遲時(shí)間要標(biāo)準(zhǔn)化。所以,一些試驗(yàn)項(xiàng)目在消除內(nèi)源性物質(zhì)干擾的同時(shí),會(huì)帶來(lái)樣品含量真實(shí)性的變化。

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